RNase A, (Ribonuklease A), M= ~13700 g/mol
CAS-Nr.: 9001-99-4, HS-Nr.: 35079090, EG-Nr.: 2326466
Lagerung: -20°C, LGK: 10-13, WGK: nwg
Spezifikation:
- Gehalt ca. 70%
- Aktivität.....70 U/mg (Kunitz)
Hinweis:
Ribonuklease A (RNase A) ist eine Endoribonuklease, die spezifisch einzelsträngige RNA 3' zu Pyrimidinresten schneidet (Cytosin, Uracil). Dadurch entstehen Pyrimidin-3'-Phosphate oder Oligonucleotide mit endständigen Pyrimidin-3'-Phosphaten. Das pH-Optimum liegt im Bereich von 7,0 - 7,5. RNase A wird für die Reinigung von RNA-freier DNA, für die Entfernung von nicht-hybridisierten Regionen von RNA : DNA-Hybriden oder als Molekulargewichtsmarker verwendet. Das Enzym wird durch Diethylpyrocarbonat (DEPC), Guanidiniumsalz (4 M GuaSCN), ?-Mercaptoethanol, Schwermetalle, Vanadylribonukleosidkomplexe, RNase-Inhibitor aus menschlicher Plazenta und durch kompetitive DNA gehemmt. Bezüglich letzterem ist denaturierte DNA wirksamer als native Nukleinsäuren. Trotzdem ist RNase A unter verschiedenen Bedingungen sehr aktiv und schwer zu inaktivieren. Bei niedrigen Salzkonzentrationen (bis zu 100 mM NaCl), schneidet RNase A einzel- und doppelsträngige RNA und RNA in RNA : DNA-Hybriden. Bei hohen Salzkonzentrationen (>300 mM NaCl) wird nur einzelsträngige RNA geschnitten. Um das Enzym aus den Proben zu entfernen, muss es mit Proteinase K verdaut werden. Meistens wird unterstützend SDS zugegeben (Endkonzentration 0,6 %). Anschließend sind einige Phenolextraktionen notwendig. Anwendungen: Enzymatische Manipulationen von DNA und RNA: Ref. 1 Suppl. 8 Seite 3.13.1, Minipreps von Plasmid-DNA: Ref. 1 Suppl. 24 Seite 1.6.6, in Situ-Hybridisierung von zellulärer RNA: Ref. 1 Suppl. 7 Seite 14.3.8, Entfernung von RNA aus Plasmidpräparationen: Ref. 2 Seite. 1.51) Stammlösungen werden in Konzentrationen von 1 - 10 mg/ml in 10 mM Tris · HCl, pH 7,5, 15 mM NaCl oder in 10 mM Tris · HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, pH 8,0 (TE-Puffer) hergestellt. Die empfohlene Arbeitskonzentration liegt bei 10 ?g/ml (Entfernung von RNA aus Plasmidpräparationen, 1 Stunde, RT) oder 100 ng/ml (Präparation von blunt end von doppelsträngiger cDNA). Einheitendefinition: Eine Einheit ist definiert als die Menge Enzym, die zur Hydrolyse von RNA mit einer Geschwindigkeitskonstanten, k = 1, bei 25°C und pH 5,0 führt (Kunitz-Einheit). Stabilität: RNase A aggregiert während der Lyophilisierung und der Lagerung. Das Enzym hat eine hohe Affinität zu Glas, was unbedingt beachtet werden muss. Bei neutralem pH (z. B. in PBS pH 7,4) und hohen Konzentrationen (> 10 mg/ml) fällt das Enzym aus. Bei +4°C (lyophilisiert und trocken gelagert) ist es über mehrere Jahre, in Lösung (-20°C) ebenfalls für mehrere Jahre und bei (+4°C) mehrere Wochen stabil.
aus Rinderpankreas salzfrei, gefriergetrocknet
